郭心雨1, 王昊天1, 张雪梅2, 王小龙2, 李和平1, 杨彦宾1, 钟凯1*
(1. 河南农业大学动物医学院, 农业农村部动物生物与营养重点实验室, 郑州 450046;2. 河南省银丰生物工程技术有限公司, 郑州 450000)
【目的】外泌体(Exo)是细胞分泌的一种活性囊泡，在正常或病理条件下，可以携带多种脂质、蛋白质、mRNA和非编码RNA，介导细胞、组织与器官之间的信息交流。牛奶Exo的成分可因乳腺感染而发生改变，然而，奶牛乳腺炎牛乳来源的Exo影响巨噬细胞表型和功能的研究极少，因此本研究通过探究牛乳来源Exo对巨噬细胞表型转化的影响，旨在探讨牛乳来源Exo是否具有影响巨噬细胞极化的能力，为进一步研究奶牛乳腺炎感染免疫机制奠定基础。
【方法】无菌采集10份牛乳样品, 通过体细胞数(SCC)测定和细菌学鉴定判断乳样性质; 差速超速离心法富集纯化牛乳来源Exo; 通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)、透射电镜(TEM)、Western blot(WB)鉴定Exo; 荧光示踪法检测Exo能否被巨噬细胞(Raw264.7)内化; 实时荧光定量PCR(RT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测牛乳来源Exo作用于Raw264.7细胞后促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子mRNA水平及蛋白水平的变化。
【结果】通过SCC判定有4份正常乳样, 6份炎症乳样; 从炎症乳样中分离出4株致病菌, 生物学特性分别与大肠杆菌、绿脓杆菌和克雷伯肺炎杆菌基本一致, 经16S rDNA基因测序比对分析证实菌株为上述致病菌; 超速离心法分离得到10份乳样Exo; 不同牛乳样本来源Exo与Raw264.7共培养6 h后均能被其内化; 与对照(Con)组相比, 低体细胞数来源Exo(L-Exo)组和高体细胞数来源Exo(H-Exo)组均能显著增加Raw264.7细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05), 一氧化氮合酶(iNOS)和巨噬细胞甘露糖受体CD206蛋白表达显著升高(P<0.05), IL-10、转化生长因子(TGF)-β的mRNA和蛋白水平下降(P<0.05), 精氨酸酶(Arg)-1 mRNA表达水平下降(P<0.05)。
【结论】在奶牛乳腺炎症反应过程中, 炎症奶牛牛乳来源Exo可促进巨噬细胞向M1型极化, 高表达促炎性细胞因子, 促进炎症反应, 而乳腺健康状态下分泌的Exo能介导巨噬细胞向M2型极化, 表达高水平的抗炎性细胞因子, 参与机体免疫调节, 有一定的抗炎作用, 证明牛乳Exo可调节巨噬细胞极化过程。