荆婷婷, 尹号, 黄蓉, 兰仕梅, 李章程, 尤留超, 郝华芳, 付磊*, 储岳峰*
(中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州大学动物医学与生物安全学院，动物疫病防控全国重点实验室，兰州 730000)
【目的】牛支原体是介于细菌和病毒之间的自然界存在的最小的最简单的能进行自我复制的原核微生物,主要通过黏附宿主组织细胞来实现在机体中的定殖，进而破坏宿主免疫屏障。本研究发现牛支原体模式菌株PG45以及08M、07801临床分离株对鼠红细胞有溶解能力，进而根据NCBI上的基因注释及序列比对找到假定的可能与溶血素相关的基因MBOVPG45_0580。通过对0580的氨基酸序列以及核苷酸序列进行分子特征分析，发现该蛋白氨基酸序列在牛支原体多种菌株中的保守性极高。通过原核表达外源性0580蛋白的C端截短体、制备其多克隆抗体、溶血试验、黏附试验等，初步分析MBOVPG45_0580在牛支原体致病机制中的生物学作用。
【方法】前期测试发现牛支原体PG45菌株、08M菌株、07801菌株都有溶解鼠红细胞的现象，根据NCBI中对PG45菌株的基因注释，筛选到1个假定与溶血素相关的基因MBOVPG45_0580。该基因编码的蛋白经预测具有4个跨膜区，全长表达困难，故构建了不含跨膜区的C端截短体原核表达载体Pcold Ⅲ-0580-C，进行诱导表达以及纯化，并在小鼠中制备0580-C端重组蛋白的多克隆抗体，对0580-C重组蛋白溶红细胞能力、多克隆抗体效价及特异性、是否影响菌株黏附细胞的能力进行了探究。
【结果】PG45菌株中假定的与溶血素相关的蛋白0580在牛支原体中的相似性高达100%，去除4个跨膜区的重组蛋白0580-C能在大肠杆菌中表达，相对分子质量约为37 ku；鼠红细胞溶血试验发现0580-C重组蛋白没有溶血活性，但黏附及黏附阻断试验发现该蛋白有助于提高牛支原体黏附EBL细胞的效率，0580-C蛋白鼠源多抗能有效阻断牛支原体对EBL细胞的黏附。制备的0580-C蛋白鼠源多克隆抗体效价达211，且能识别到3株牛支原体菌株(PG45、08M、07801)天然表达的0580蛋白，表明制备的0580-C蛋白鼠源多克隆抗体特异性较好。
【结论】牛支原体中假定的与溶血素相关蛋白0580可能是一种新的黏附相关分子，为解析牛支原体MBOVPG45_0580基因的生物学功能以及牛支原体致病机制提供了新的见解。