蔡明玉1,2, 张海龙1,2, 海珍珍1,2, 乔亚蕊1,2, 杜军1,2*, 周学章1,2*
（1. 宁夏大学生命科学学院, 银川 750021;2. 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室, 银川 750021)
【目的】念珠菌是一种人畜共患的条件性致病真菌。克柔念珠菌(Candida krusei)的研究主要集中于其生物学特性、治疗药物的开发和逆转耐药性方面，对于克柔念珠菌与宿主细胞相互作用的特征和机制研究较少。细胞外囊泡(EVs)是一种细胞分泌的膜性囊泡，根据产生机制和粒径大小分为3类：微囊泡、凋亡小体和外泌体。14-3-3蛋白在所有真核细胞中广泛表达，通过不同的分子作用机制在众多细胞进程中起非常关键的作用，包括细胞生长与增殖、细胞分化、信号转导、细胞凋亡和转录调控等。本试验通过明确rCK14-3-3作用MAC-T后炎症反应的分子机制，以确证rCK14-3-3是否为引起MAC-T炎症的重要因子，为深入研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供依据。
【方法】采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定；CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间；Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响；ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-12相对表达量的影响。
【结果】成功构建了pET-21a-BMH1重组表达载体，经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白，纯度达90%以上，浓度为0.2 mg·mL-1。与空白对照组相比，采用50 μg·mL-1的rCK14-3-3作用MAC-T，TLR2、TLR4、MyD88在1、3 h时表达量极显著升高（P<0.01），6 h时，TLR4表达量显著降低（P<0.05），TLR2、MyD88表达量无显著变化；p-JNK在1 h时的表达量无显著变化，3、6 h时极显著降低（P<0.01）；p-ERK在1、3、6 h时的表达量显著或极显著升高（P<0.05，P<0.01）；p-p38在1 h时的表达水平极显著降低（P<0.01），3、6 h时极显著升高（P<0.01）；p-IκB-α、p-p65在1、3、6 h时的表达量均极显著升高（P<0.01）。IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α在作用1、3、6 h后均呈现出显著或极显著的上调趋势（P<0.05，P<0.01）；IL-6在作用1、3 h后极显著上升（P<0.01），6 h后显著降低（P<0.05）；IL-12在作用1 h后极显著上升（P<0.01），3、6 h后极显著降低（P<0.01）。
【结论】本研究成功表达具有生物学活性的rCK14-3-3蛋白，该蛋白可通过TLR2/4-MAPK/NF-κB信号通路诱导MAC-T发生炎性反应，rCK14-3-3蛋白可作为引起MAC-T炎症的重要因子之一。