海藻酸钠-乳铁蛋白复合益生菌微胶囊的制备及性能研究
引用本文请复制：王道滇，马月星，等.海藻酸钠-乳铁蛋白复合益生菌微胶囊的制备及性能研究.中国奶牛.2023年第2期（总第394期）：43-51页
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中图分类号：TS252.1
文献标识码：A
文章编号：1004-4264（2023）02-0043-09
DOI：10.19305/j.cnki.11-3009/s.2023.02.010
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海藻酸钠-乳铁蛋白复合益生菌
微胶囊的制备及性能研究
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王道滇，马月星，魏光强，王浩，黄艾祥
（云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201）
摘 要：益生菌具有多种益生功能，但其活性在贮藏和胃肠道消化过程中会有所下降，导致其益生特性降低。益生菌微胶囊化能提升其抵抗不良环境的能力。本研究通过构建海藻酸钠-乳铁蛋白微胶囊，包封干酪乳杆菌Zhang，通过单因素筛选和响应面优化最佳的海藻酸钠-乳铁蛋白复合益生菌微胶囊工艺参数；此外研究了干酪乳杆菌Zhang微胶囊的消化稳定性、贮藏稳定性、热稳定性和发酵特性。结果表明，海藻酸钠-乳铁蛋白复合益生菌微胶囊的最佳工艺条件为：乳铁蛋白浓度2.30%、低聚果糖浓度1.60%、固化时间20min，此时活菌数达到最高，为8.64log(CFU/mL)；复合益生菌微胶囊具有良好的消化稳定性、贮藏稳定性、热稳定性，与未包埋的干酪乳杆菌Zhang相比，微胶囊化组的活菌数分别高了0.85、0.43、0.17个对数级；体外发酵特性实验表明，微胶囊化组在牛奶中发酵14h后的pH为4.41，高于未包埋组的4.13。海藻酸钠-乳铁蛋白复合微胶囊对干酪乳杆菌Zhang具有明显的保护作用，本研究为益生菌微胶囊的进一步开发利用奠定基础，为促进新型益生菌制品的开发和发展提供了有益尝试。
关键词：干酪乳杆菌Zhang；微胶囊；工艺优化；稳定性；发酵特性
益生菌是指对肠道有益的非致病性微生物，具有多种生物活性，摄入足够数量的益生菌会对人体健康产生有益影响。干酪乳杆菌Zhang是从内蒙古地区传统的发酵型酸马奶中分离筛选出的性能优异的益生菌，能够调节人体免疫反应和肠道微生物群组成和特别增强健康成年人和老年人群的抗炎和抗氧化作用。干酪乳杆菌Zhang具有良好的发酵特性，能分泌丰富的胞外多糖。此外，还具有降低血脂、调节免疫系统、抗氧化、预防治疗肿瘤等多种对人体有益的功能。干酪乳杆菌Zhang的益生功能和发酵特性在食品工业中有较大的应用价值。但在食品加工贮藏以及人体消化过程中，益生菌极易失去活性，难以发挥其肠道益生作用。因此，如何有效提高益生菌在食品加工和贮藏过程中的耐受性和活菌数已成为当前有待研究解决的问题。
微胶囊技术对益生菌的包埋与封装可以将其与外界逆环境隔离，以减少不利因子对益生菌的干扰，是有效保存益生菌活力的策略之一，成为目前国际上一个研究热点。乳铁蛋白是一种功能性铁糖结合蛋白，可以改善肠道健康、抑制有害菌在肠道内的黏附定植和生长、调节肠道宿主免疫和促进益生菌生长。乳铁蛋白具有较好的生物可降解性、生物相容性和优良的乳化能力，能够增加乳液的化学稳定性。可将其应用于微胶囊的壁材，既能发挥乳铁蛋白抗菌、降血压、抗炎和免疫调节等功效，又能有效提高益生菌的胃肠道抗性，增强微胶囊的紧实程度，从而实现对益生菌活性的保护作用。然而，乳铁蛋白在益生菌微胶囊中应用的研究鲜见报道。
鉴于益生菌存在耐酸性和贮藏性差，经胃肠消化进入人体后不能有效发挥益生作用的问题，本研究以海藻酸钠和乳铁蛋白作为壁材，包裹芯材——干酪乳杆菌Zhang来制备复合益生菌微胶囊，以活菌数为指标，通过单因素筛选和响应面试验确定最佳益生菌微胶囊化的工艺参数来开发一种对益生菌有保护作用的微胶囊，并对其消化稳定性、贮藏稳定性、热稳定性及发酵特性进行评价。研究可为益生菌微胶囊的进一步开发利用奠定基础，在丰富益生菌产品类型、促进新型益生菌发酵产品的发展上提供新思路。
1材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂
干酪乳杆菌Zhang，北京科拓恒通生物技术开发有限公司。德运脱脂乳粉，河南洲洲海优国际贸易有限公司；乳铁蛋白（食品级），河南深海食品配料有限公司；海藻酸钠（食品级），青岛明月海藻集团有限公司；低聚果糖（食品级），河南万邦化科技有限公司；乳酸钙，郑州瑞普生物工程有限公司；柠檬酸钠，天津市瑞金特化学品有限公司；MRS肉汤培养基，广东环凯微生物科技有限公司；胃蛋白酶（≥250U/mg）、胰蛋白酶（≥250U/mg），北京索莱宝科技有限公司。
1.1.2 仪器与设备
DIX-3500高速混匀震荡器，上海岛韩实业有限公司；50mL医用无菌一次性注射器，江苏治宇医疗器械有限公司；STARTER-3100pH计，美国奥豪斯仪器有限公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HPX-9272ME磁力搅拌器，上海泸粤明科学仪器有限公司；LDZF-50KB立式压力蒸汽灭菌器，北京市永光明医疗仪器有限公司；SWCJ-IF超净无菌操作台，苏州江东精密仪器有限公司；HPX-9272ME恒温培养箱，上海博讯实业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 锐孔-凝固浴法制备海藻酸钠-乳铁蛋白复合益生菌微胶囊
海藻酸钠-乳铁蛋白复合益生菌微胶囊的制备根据徐鹏翔和刘月等人的方法稍作修改。具体如下：
复合壁材的配制∶分别称取1.5g乳铁蛋白、1.0g低聚果糖、海藻酸钠定容于100mL无菌水中，充分溶解后备用。微胶囊的制备∶在无菌室的超净工作台内，将制备好的细胞菌悬液以1∶4（v/v）的比例与无菌复合壁材（灭菌条件：115℃，20min）混合，用无菌玻璃棒搅拌均匀，静置片刻，然后用50mL的一次性医用注射器吸取菌液壁材混合物，通过32G针头以距离液面40cm左右的高度逐滴滴入到50mL质量分数为2%的无菌乳酸钙溶液中，在磁力搅拌器的外力作用下（400r/min）均匀固化30min形成微胶囊。然后取出用0.9%（w/v）无菌生理盐水冲洗三次，洗去固定化微胶囊表面剩余的乳酸钙和菌体，得复合微胶囊，于无菌室内4℃冰箱中贮存备用。
1.2.2 锐孔-凝固浴法益生菌微胶囊工艺设计
工艺设计流程见图1。
图1 锐孔-凝固浴法制备微胶囊示意图
1.2.3 菌种的活化及菌悬液的制备
参照景安琪等的方法，稍作修改。在无菌条件下，将干酪乳杆菌Zhang菌粉以1%的接种量接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h，将发酵液振荡摇匀后，离心15min（4℃，6 000r/min），弃上清液，收集菌体，并用无菌水洗涤，离心沉淀，用高速混匀振荡器使菌体和无菌水充分混合均匀，再次离心，前后重复3次。用50mL无菌水悬浮菌泥，即为菌悬液，重悬后的菌悬液用于后续的包埋实验，置于4℃冷藏柜备用。
1.2.4 益生菌微胶囊工艺优化
通过单因素试验考察不同乳铁蛋白浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%）、不同低聚果糖浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0%）和不同固化时间（10、20、30、40、50min）对益生菌微胶囊活菌数的影响。基于单因素实验，利用响应面优化最佳工艺。响应面试验因素的选取及每个水平的确定如表1所示。
表1 响应面试验分析因素与水平
1.2.5 益生菌微胶囊稳定性研究
图2为微胶囊性能测定示意图，研究其消化稳定性、贮藏稳定性、热稳定性和发酵特性。
图2 微胶囊性能测定示意图
1.2.5.1 乳酸菌活菌数测定
根据GB4789.35-2016平板计数法，测定乳酸菌活菌数。
1.2.5.2 益生菌微胶囊消化稳定性的测定
人工模拟胃液的配制：参照石月的方法，稍作修改。移取1.64mL的0.5mol/L稀HCl于90mL无菌蒸馏水中，将pH调至2.0，加入胃蛋白酶1.00g，充分摇匀，用无菌水定容至100mL，置于4℃冷藏柜备用。
人工模拟肠液的配制：参照石月的方法，稍作修改。量取适量pH为7的PBS缓冲溶液于烧杯中，加入胰蛋白酶1.00g，充分摇匀，用无菌水定容至100mL，置于4℃冷藏柜备用。
消化稳定性的测定：参照周莉等的方法，稍作修改。称取1.0g制备好的益生菌微胶囊于无菌离心管中，加入到9mL人工模拟胃液中，充分摇匀15s后，在37℃条件下，以180r/min在摇床中分别震荡处理0、1、2、3h后，分别取样，以平板菌落计数法测定活菌数。再将经人工模拟胃液处理过后的样品以4 000r/min离心5min，弃去上清液，取沉淀，加入到30mL人工模拟肠液中，充分摇匀（15s），在37℃条件下，以180r/min在摇床中分别震荡处理0、1、2、3h后，分别取样，通过平板菌落计数法测定干酪乳杆菌Zhang活菌数。对照组为未经包埋的裸菌，按相同的方法测定不同消化时间段的活菌数。两组实验结果进行对比，得出结论。
1.2.5.3 益生菌微胶囊贮藏稳定性的测定
参照周莉等的方法，稍作修改。将制备好优化包埋的益生菌微胶囊置于4℃条件下贮藏21d，每隔7d取样测活菌数，将微胶囊置于0.06mol/L柠檬酸钠解囊液中崩解至完全溶解后进行测定。对照组为未经包埋的裸菌，按以上相同的方法测定不同贮藏天数的活菌数。两组实验结果进行对比，得出结论。
1.2.5.4 益生菌微胶囊热稳定性的测定
称取1g微胶囊，量取1mL菌液，形成包埋和未包埋对照，分别置于无菌烧杯。在95℃的温度下，水浴加热1min，冷水快速冷却30s，将微胶囊置于0.06mol/L柠檬酸钠解囊液中崩解至完全溶解后，用平板菌落计数法测定两个样品的活菌数。两组实验结果进行对比，得出结论。
1.2.5.5 益生菌微胶囊发酵特性的测定
MRS肉汤中发酵特性：称取1g微胶囊，量取1mL菌液，分别置于10mL MRS肉汤中，在37℃发酵培养，每隔2h用pH计测定样品的pH值。测定7组，研究其发酵特性。
发酵牛奶中发酵特性：称取两份10g脱脂乳粉制成10%的脱脂乳，搅拌均匀，加热溶解，待其冷却至室温。称取1g微胶囊，量取1mL菌液，分别置于灭菌包装盒中，在37℃发酵培养，每隔2h用pH计测定样品的pH值。测定7组，研究其发酵特性。
1.3 数据处理及统计分析
本试验使用SPSS25.0软件、Origin2021b、Design-Expert8.0.6软件对数据进行处理和作图分析。
2结果与分析
2.1 单因素试验制备益生菌微胶囊
2.1.1 乳铁蛋白浓度对益生菌微胶囊活菌数的影响
乳铁蛋白是一种铁糖结合蛋白，对人体有很多益处，对益生菌活性有保护作用。试验测定了不同乳铁蛋白浓度对益生菌微胶囊活菌数的影响，结果如图3所示。
图3 乳铁蛋白浓度对干酪乳杆菌Zhang活菌数的影响
由图3可知，添加不同浓度的乳铁蛋白制作微胶囊，乳铁蛋白添加量对干酪乳杆菌Zhang活菌数有显著影响。随着乳铁蛋白浓度的增加，活菌数呈先上升后下降趋势。当乳铁蛋白浓度小于2%时，活菌数呈上升趋势，这可能是因为低浓度的乳铁蛋白体系黏合力较小，对干酪乳杆菌Zhang的扩散有较强的抑制作用，提升其包埋量，有利于益生菌的生长代谢。然而，低浓度的壁材体系不能够形成一个致密的网络体系来实现对菌体的完全包埋，即不能达到最高活菌数。当乳铁蛋白浓度为2%时，此时，乳铁蛋白与海藻酸钠结合度提高，形成更致密的凝胶结构，使微胶囊更稳定，此时活菌数达到最大值8.87log（CFU/mL），有利于菌体发挥更好的益生效果。当乳铁蛋白浓度大于2%时，活菌数下降，原因可能是混合体系溶液的黏度过高，附着力增加，使混合溶液很难被挤压成球，不利于产品在凝固浴中固化，导致微胶囊化效率降低，从而活菌数下降。周莉等研究海藻酸钠-乳清蛋白复合益生菌微胶囊构建得出乳清蛋白的最佳浓度为10%，这可能是由于包埋方法和壁材不同导致其交联作用和复合效果的差异。综上所述，益生菌添加乳铁蛋白的最适浓度为2%。
2.1.2 低聚果糖浓度对益生菌微胶囊活菌数的影响
低聚果糖是一种对益生菌生长有益的益生元，可以提高益生菌在胃肠道中的存活率，间接改善肠道健康。试验测定了不同低聚果糖浓度对益生菌微胶囊活菌数的影响，结果如图4所示。
图4 低聚果糖浓度对干酪乳杆菌Zhang活菌数的影响
由图4可知，不同低聚果糖浓度对干酪乳杆菌Zhang活菌数有影响，随着低聚果糖浓度的增加，活菌数呈先上升后下降趋势。其中，当低聚果糖浓度为1.5%时，对益生菌的促生长效果最好，活菌数达到最大值8.79log（CFU/mL）；这与卢旭等研究莲子低聚糖添加量对双歧杆菌生长影响的结果相似。当其浓度小于1.5%时，活菌数上升，原因可能是适当浓度的低聚果糖既可以填充凝胶体系之间的空隙，延缓菌体的释放，又可以促进干酪乳杆菌Zhang的增殖。当低聚果糖浓度大于1.5%时，活菌数呈下降趋势，这可能是低聚果糖浓度过高导致高渗环境致使菌体脱水，结构被破坏，从而影响菌体的生长代谢。综上所述，低聚果糖的最适添加浓度为1.5%。
2.1.3 固化时间对益生菌微胶囊活菌数的影响
不同的固化时间会对微胶囊的形态大小及活菌数产生一定的影响。试验测定了不同固化时间下活菌数的变化，结果如图5所示。
图5 固化时间对干酪乳杆菌Zhang活菌数的影响
由图5可知，干酪乳杆菌Zhang活菌数随着固化时间的延长呈先上升后下降的趋势。固化时间小于30min时，活菌数呈上升趋势，原因可能是磁力搅拌固化过程中，力的作用促进了芯材分散，一定程度上乳化了芯材，能增大芯材与壁材的接触面，从而促进壁材对干酪乳杆菌Zhang的包埋。当固化时间为30min时，活菌数达到最大，为8.80log（CFU/mL），此时固化更完全，液滴大小合适，制备的微胶囊质量较好，形态结构规则，没有拖尾现象，可以有效保证芯材的稳定性。固化时间大于30min时，微胶囊的囊壁厚度在延长固化时已经固定。随着固化时间的延长，乳酸钙中Ca2+过多释放导致微胶囊过度固化，影响分子缔合物的形成以及过饱和的Ca2+造成微胶囊脆性的增加；且过饱和的Ca2+会损伤菌体细胞壁膜，不利于微生物生长代谢，从而造成活菌数降低。本研究对干酪乳杆菌Zhang包埋选择的最佳固化时间低于孙亚利等对荞麦黄酮包埋所用的最佳固化时间。这可能是因为使用混合壁材可以弥补单一壁材对益生菌包埋保护性能的缺陷，加快芯材与壁材的交联反应，从而提高包埋率，缩短固化时间。综上，30min是制备益生菌微胶囊的最佳固化时间。
2.2 微胶囊工艺优化
2.2.1 响应面方差分析
基于单因素试验，利用响应面Box-Behnken试验设计，选取乳铁蛋白浓度（A）、低聚果糖浓度（B）、固化时间（C）3个因素，进行3因素3水平的试验设计，优化复合益生菌微胶囊的最佳工艺参数。响应面分析因素及水平见表2。
表2 响应面分析方案及结果
2.2.2 模型建立及显著性检验
利用Design-Expert8.0.6软件对表2进行多元回归拟合，得到复合益生菌微胶囊活菌数（Y）与乳铁蛋白浓度（A）、低聚果糖浓度（B）和固化时间（C）的二次方程模型为Y=5.126+2.272A+1.419B+（9.95-03）C-0.05AB-（9.50E-03）AC+（1.50E-03）BC-0.453A2-0.453B2+（1.18E-04）C2。回归模型的方差分析结果见表3。
表3 复合微胶囊活菌数回归模型方差分析表
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
由表3方差分析可知：回归模型显著性检验P＜0.0001＜0.01，说明两者二次多元回归模型极显著；回归模型失拟性检验P=0.26＞0.05，可以认为所选回归模型与实际试验拟合性充分，模型失拟不显著。感官评分回归诊断表明，决定系数R2=98.16%，信噪比Adeq precisior=20.74，这表明方程的拟合度和可信度均很高，可用于预测复合益生菌微胶囊活菌数。离散系数C.V（Y的变异系数）表示实验本身的精确度，C.V值越小，实验的可靠性越高，本实验拟合C.V值为0.23%。综上所述，回归模型拟合程度良好，试验误差小，能准确地分析和预测复合益生菌微胶囊活菌数，表明实验操作可信度高，具有一定的实践指导意义。由回归系数显著性表明，在所取因素水平范围内，各因素对复合益生菌微胶囊活菌数影响的顺序为：乳铁蛋白浓度＞低聚果糖浓度＞固化时间。
2.2.3 响应面优化
通过观察图6中响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映复合益生菌微胶囊的乳铁蛋白浓度（A）、低聚果糖浓度（B）和固化时间（C）交互作用对复合益生菌微胶囊活菌数的影响，当等高线为圆形时，表明这两个因素之间的交互作用不显著，当等高线为椭圆形或马鞍形时，则表明这两个因素之间的交互作用显著。
图6 响应面优化
图6为一次回归方程拟合得到的响应值Y的等高线及三维曲面图，是回归方程的形象描述。由图6可知，乳铁蛋白浓度A与固化时间C之间交互作用显著（P＜0.05），对复合益生菌微胶囊活菌数影响较大；由图可知，益生菌微胶囊活菌数随乳铁蛋白浓度和固化时间的增加呈先增加后减小的趋势，乳铁蛋白浓度和固化时间分别为2.30%和20min时活菌数最高，这与单因素结果有一定差距，原因可能是活菌数计数中存在不可定因素，且固化时间影响不显著，因此造成一定差距。
2.2.4 最佳条件的确定和回归模型的验证
回归模型通过响应面法得到的结果为：乳铁蛋白浓度2.30%，低聚果糖浓度1.59%，固化时间20.08min。考虑实际操作情况与设备参数状况，确定复合益生菌微胶囊的最佳工艺参数为：乳铁蛋白浓度2.30%，低聚果糖浓度1.60%，固化时间20min，此时复合益生菌微胶囊的活菌数预测值为8.85log（CFU/mL）。在上述最佳条件下进行验证实验，得到复合益生菌微胶囊的活菌数评分值为8.64 log（CFU/mL），与理论值接近。
2.2.5 益生菌微胶囊外观图及评价
如图7所示，制备的干酪乳杆菌Zhang微胶囊形状规则且大小较为均匀，肉眼可以看到淡粉色球形，有轻微的乳香味，没有不良感官性状，也没有拖尾现象。表面光滑，空隙也较小，基本无粘连，有弹性，流动性良好，粒径为1.50～2.30mm，基本达到预期效果。
图7 干酪乳杆菌Zhang微胶囊外观图
2.3 益生菌微胶囊稳定性的测定
2.3.1 益生菌微胶囊消化稳定性的测定
干酪乳杆菌Zhang在模拟胃肠液中的存活率不仅是菌体通过胃肠道中发挥益生作用的重要保障，也是微胶囊保护效果的重要指标。试验为干酪乳杆菌Zhang在体外模拟消化道中的耐受性的测定，结果如图8所示。
图8 干酪乳杆菌Zhang在连续体外模拟消化道中的存活结果
由图8可知，随着模拟胃肠液消化时间的延长，其包埋和未包埋的干酪乳杆菌Zhang活菌数均呈现缓慢下降的趋势。原因可能是胃液中的低酸环境会使微胶囊的复合壁材受到一定损伤，导致部分益生菌暴露于过酸环境中，从而活菌数下降。微胶囊包埋的干酪乳杆菌Zhang在模拟胃液中活菌数有所下降，但变化不显著；是因为微胶囊具有更好的机械性能和抵御胃酸的能力，一定条件下提高了益生菌对不良环境的抗逆性。在随后3h的模拟肠消化的处理中，微胶囊包埋的干酪乳杆菌Zhang活菌数达到7.91log（CFU/mL）；未包埋的活菌数急剧下降，为7.06log（CFU/mL）。这可能是作为传递载体海藻酸盐与Ca2+和乳铁蛋白之间形成稳定的交联结构，增强了益生菌在胃环境中的稳定性并实现在肠内的控制释放[28]。而未包埋的菌体难以耐受肠液环境，导致菌体损失量较大。综上结果表明，微胶囊包埋不仅能够增强益生菌对胃酸的耐受性，也能提高对肠液的耐受性。这与屈方宁等[29]对海藻酸钠微胶囊包埋植物乳杆菌ST-Ⅲ保护效果的研究相似。
2.3.2 益生菌微胶囊贮藏稳定性的测定
试验为干酪乳杆菌Zhang在4℃条件下贮藏21d的稳定性测定，结果如图9所示。
图9 干酪乳杆菌Zhang在4℃贮藏21d的存活结果
由图9可知，随着贮藏天数的延长，其包埋和未包埋的干酪乳杆菌Zhang活菌数均呈现缓慢下降的趋势，但包埋的下降趋势相对较缓。这可能是由于随着贮藏时间的延长，益生菌代谢产生的代谢物抑制了活菌的生长繁殖。未包埋的益生菌在贮藏21d后活菌数下降至7.54log（CFU/mL），而经过微胶囊包埋处理的益生菌活菌数仍能保持在7.97log（CFU/mL），表现出了较好的贮藏性能，原因可能是干酪乳杆菌Zhang对于贮藏的环境要求较高，低温环境（4℃）能够抑制干酪乳杆菌Zhang的活性，从而减弱其代谢率，使菌体处于休眠状态。经过包埋处理后，菌体外包裹了一层高分子膜，增强了对外界的抵抗能力，使贮藏过程中菌体仍有较高活性，故活菌数较高。其次，包埋过程中添加的低聚果糖促进了益生菌的生长繁殖，增强了干酪乳杆菌Zhang贮藏过程中的稳定性。综上结果表明，微胶囊包埋能提高干酪乳杆菌Zhang的贮藏稳定性。
2.3.3 益生菌微胶囊热稳定性的测定
试验为干酪乳杆菌Zhang经95℃高温处理后稳定性的测定，结果如图10所示。
图10 干酪乳杆菌Zhang经95 ℃高温处理后的存活结果
由图10可知，经95℃的高温处理后，微胶囊化的干酪乳杆菌Zhang活菌数比未包埋的高。包埋的活菌数为8.73log（CFU/mL），未包埋的为8.56log（CFU/mL）。这可能是因为高温环境下，双层壁材减少了益生菌的渗漏还延长了热水扩散路径长度，对益生菌微胶囊有较好的热保护作用。而没有壁材保护作用的益生菌直接暴露于恶劣环境条件下，导致其生长繁殖能力变弱，造成活菌数较少。其次，低聚果糖与海藻酸钠在聚合体内形成具有自由连接位点的氢键，填充了微胶囊的凝胶网络的空隙，使其形成致密的结构，增加了微胶囊的强度和密度，从而提高了益生菌微胶囊对高温的耐受性。综上结果表明，微胶囊包埋能提高益生菌细胞的热稳定性。
2.3.4 益生菌微胶囊发酵特性的测定
2.3.4.1 干酪乳杆菌Zhang在MRS肉汤中发酵特性的测定发酵过程中，发酵液pH值大小变化是乳酸菌活力的主要评价指标。pH值的变化主要取决于培养基成分和微生物的代谢特性。试验为干酪乳杆菌Zhang在MRS肉汤中发酵特性的测定，结果如图11所示。
图11 干酪乳杆菌Zhang在MRS肉汤中发酵特性的测定结果
由图11可知，在37℃发酵过程中，随着发酵时间的延长，其包埋和未包埋的干酪乳杆菌Zhang在MRS肉汤中的pH值下降趋势大致相似。发酵2h后pH值急剧下降，这是益生菌在发酵液中的生长特性所导致的。发酵初期，加入菌粉，pH的变化很小；2h后益生菌处于对数生长期，大量繁殖，pH值快速下降；发酵后期代谢物和酸度积累抑制菌体生长，致使pH值下降变缓。整体上看未包埋的pH值下降趋势较快，由6.47下降至4.27，这可能是因为菌体未被包埋，没有壁材的保护，发酵程度会更高，但pH值在发酵终点时相差不大，包埋的为4.71，未包埋的为4.27。说明包埋与未包埋的菌株对发酵基质的利用率相近。综上，微胶囊包埋的干酪乳杆菌Zhang在MRS肉汤中具有良好的发酵特性。
2.3.4.2 干酪乳杆菌Zhang在牛奶中发酵特性的测定
pH值是酸奶风味和组织状态的重要指标。将包埋和未包埋的干酪乳杆菌Zhang接种到牛奶中进行发酵，对其发酵特性进行测定，结果如图12所示
图12 干酪乳杆菌Zhang在牛奶中发酵特性的测定结果
由图12可知，在37℃发酵过程中，随着发酵时间的延长，包埋和未包埋的干酪乳杆菌Zhang在牛奶中的pH值均呈下降趋势，但发酵终点的pH值相差不大，其发酵乳组织状态良好，有浓郁的酸奶味。发酵初期pH下降缓慢，2h后则急剧下降；原因可能是发酵开始时蛋白质含量高对pH有一定的缓冲能力，2h后菌株处于对数生长期，其利用牛奶中的碳源产生乳酸，使得发酵乳的酸度迅速增加，导致pH值快速下降，同时也使得牛奶中的乳酪蛋白凝集沉淀，使发酵乳变得又酸又稠。此外，发酵过程中产生的胞外多糖可以增强牛奶中蛋白网络体系之间的相互作用以及凝胶分子间的静电作用力导致发酵乳黏度发生变化，从而影响发酵酸度的变化。10h后，发酵过程中菌体及次生代谢物的积累可能会在一定程度上降低发酵环境pH值；发酵14h后，发酵乳有少量乳清析出。此时包埋的pH值为4.41，未包埋的为4.13。随着发酵时间的延长，发酵乳pH值降低到酪蛋白等电点，利于发酵乳凝胶的形成；但随着酸性的增加会破坏原来的凝胶状结构，导致水分从乳中分离，并在此过程中生成乳清。整体上看，裸菌发酵的发酵乳pH下降趋势较快，这可能是因为菌体未被包埋，没有壁材的保护，发酵程度会更高。综上，微胶囊包埋前后的干酪乳杆菌Zhang在牛奶中都具有良好发酵特性，说明可以将微胶囊包埋的干酪乳杆菌Zhang应用于发酵乳制品中。
3结论
通过单因素和响应面优化确定了海藻酸钠-乳铁蛋白复合干酪乳杆菌Zhang微胶囊的最佳工艺条件为：乳铁蛋白浓度2.30%、低聚果糖浓度1.60%、固化时间20min。复合益生菌微胶囊能提升干酪乳杆菌Zhang对胃酸和肠液的耐受性能、贮藏期稳定性和耐热性能，与未包埋的干酪乳杆菌Zhang相比，微胶囊化组的活菌数分别高了0.85、0.43、0.17个对数级。海藻酸钠-乳铁蛋白复合干酪乳杆菌Zhang微胶囊具有良好发酵特性，在发酵乳制品的应用中具有一定的潜力。海藻酸钠-乳铁蛋白复合微胶囊对干酪乳杆菌Zhang具有明显的保护作用，本研究为益生菌微胶囊的进一步开发利用奠定了基础，为促进新型益生菌制品的开发和发展提供了有益尝试。