如何提交高质量临床病理样本提高奶牛群体疾病诊断准确性？

王建中 博士山西农业大学动物医学院副教授

谢 瑜  山西农业大学动物医学院本科三年级学生

张廷青 博士

      健康动物是生产性能正常动物，这包括工作犬、伴侣、牧场工作马匹、产蛋鸡、繁育家畜、奶牛或育肥牛。在追求动物健康和欢愉性（福利）管理过程中，临床当值兽医和养殖者常常需要在获得可靠且准确诊断的诊断成本、有效治疗成本、后续护理成本、可能预后，以及康复后收益之间反复权衡。临床病理学（血液和/或组织/体液检测）是一种高效和高性价比诊断选择，能够提供广泛而深入的有价值数据。不过，是否可最大限度地发挥临床病理检测潜在效用，则取决于所采集样本既能代表疾病或病变，又具有适当诊断价值。因此，目标是获取并提交高质量、具有最高诊断价值的代表性样本，以提供可靠诊断结果，使临床当值兽医能够信心饱满地做出判断。缺乏这种信心，仅依赖推测性诊断充其量也是不稳定的。质量不佳样本会导致模棱两可病理报告，使所有相关方——诊断人员、临床当值兽医和养牛场主——感到沮丧，同时也会影响患牛治疗效果，导致病程延长、生产力下降、成本增加和/或预后不良。进而，这可能导致养牛场主和/或临床当值兽医丧失提交诊断样本积极性，减少样本提交量……从而形成恶性循环。

      临床诊断患牛时，临床当值兽医会根据患牛特征、病史、临床症状和常规体检结果，确定哪个器官系统受影响。继之制定初步问题和鉴别诊断（differential diagnosis=ddx）列表，通常使用缩略词，例如 DAMNIT（Degenerative=退行性、Amonalous=先天异常、Metabolic=代谢性、Nutritional-Neoplatic=营养性-肿瘤性、Inflammatory-Idiopathic-Iatrogenic=炎症性-特发性-医源性、Toxin-Traumatic=毒素-创伤性）或 VITAMIND（Vascular=血管性、Inflammatory=炎症性、Toxin-Traumatic=毒素-创伤性、Metabolic=代谢性、Idiopathic-Iatrogenic=特发性-医源性、Nutritional-Neoplastic=营养性-肿瘤性、Degenerative=退行性）。然后依据上述列表选择诊断测试项目和方法（参阅表1）。当诊断某些疾病时，如果全血细胞计数（complete blood count=CBC）和血清生化实验室检测能够提供有价值信息，那么所选择的具体检测应基于假定受疾病影响的器官系统。这样做的目的是要么排除某种疾病，要么监测该疾病发展或治疗反应（参阅表2）。

      一旦选择了拟采用的诊断测试，临床当值兽医必须确定获取最佳代表性样本方法，并以能优化其诊断质量方式采集这些样本。以下内容并非详尽的操作指南，而是针对提交至临床病理诊断实验室进行检测时，优化样本提交的常识性“应做与不应做”建议。

表1. VITAMIND 鉴别诊断列表有哪些检测项目？

¹ 可提供器官系统受疾病或病理状况影响证据。

VITAMIND 鉴别诊断列表（VITAMIND Differential List）是一种帮助临床当值兽医系统性思考疾病鉴别诊断工具，有助于系统性分析疾病可能病因，继而提高诊断准确性。VITAMIND 代表不同类别病因：

• V(Vascular)=血管性疾病（如血栓、出血、缺血）。

• I(Infectious/Inflammatory)=感染性或炎症性疾病（如细菌、病毒、寄生虫感染）。

• T(Trauma/Toxic)=创伤或中毒（如物理损伤、化学毒素）。

• A(Anomalous)=先天性或遗传性异常（如遗传病、发育缺陷）。

• M(Metabolic)=代谢性疾病（如电解质失衡、内分泌疾病）。

• I(Idiopathic/Iatrogenic)=特发性或医源性疾病（如原因不明疾病、药物副作用）。

• N(Neoplastic/Nutritional)=肿瘤或营养相关疾病（如癌症、维生素或矿物质缺乏）。

• D(Degenerative)=退行性疾病（如关节炎、神经退行性疾病）。

表2.诊断特定器官系统受损常用哪些检测？

英文缩写中文含义：ALP（alkaline phosphatase）=碱性磷酸酶；AST（aspartate aminotransferase）=天冬氨酸转氨酶；BHB（beta-hydroxybutyrate）=β-羟丁酸；GGT（gamma-glutamyl transferase）=γ-谷氨酰转移酶；GMD/GDH/GLDH（glutamate dehydrogenase）=谷氨酸脱氢酶；HCT（hematocrit）=血细胞比容；IDH（isocitrate dehydrogenase）=异柠檬酸脱氢酶；LDH（lactate dehydrogenase）=乳酸脱氢酶；NEFA(nonesterified fatty acids)=非酯化脂肪酸；PCV (packed cell volume)=红细胞压积；RBC(red blood cell)=红细胞；SDH(sorbitol dehydrogenase)=山梨醇脱氢酶；UPC(urine protein to creatinine ratio)=尿蛋白/肌酐比值；USG(urine specific gravity)=尿比重；vWF(vonWillebrand Factor)=冯·维勒布兰因子；von Willebrand 因子（vWF）是一种对血液凝固至关重要的大型糖蛋白，其在止血过程中起着关键作用，主要通过介导血小板粘附到受损血管并稳定另一种重要凝血蛋白凝血因子VIII。

所有异常生长和/或器官实质异常均可通过细针穿刺活检结合细胞学评估进行检查。该程序旨在确定所采集组织的性质，包括是否为正常组织、增生性改变、炎症性病变或肿瘤（良性或恶性）。为了获得具有诊断价值的样本，提交的载玻片必须满足以下条件：

1.采集自适当组织；

2.含有足够数量且完整的有核细胞，以确保能代表采样组织；

3.细胞铺展良好，以便清晰观察单个细胞及其内部结构；

4.最大程度减少细胞破损或裂解。

因此，建议在提交之前对其中一张样本载玻片进行初步评估，具体方法随后讨论。尽管误取非目标组织情况较为罕见，但仍可能发生。样本采集可采用多种技术，具体选择取决于目标组织和/或病变的特性。为了获得最佳诊断效果，建议针对每个采样病变获取并提交4至6张载玻片。关于具体的采样技术步骤，可参考相关文献，本文不作详细讨论。

• 啄木鸟取样技术采用21–23号针头、90厘米左右静脉延长管和6-12毫升注射器，在不施加负压情况下，可在大多数组织类型中实现最佳取样效果。该技术关键在于快速、多角度刺入目标组织，以从多个平面获取样本，从而提高诊断价值。这种快速刺入方式使针芯填充组织细胞，称为“啄木鸟技术”。由于未施加负压，该方法可有效减少细胞破裂发生。如使用较大口径针头，样本可能过于浓稠，而使用较小口径针头则可能导致细胞量不足，从而影响诊断准确性。

• 啄木鸟抽吸技术使用与上述相同设备，但在将针头插入目标组织后，施加约1毫升负压。过大负压可能导致细胞破裂增多，而较小注射器则可能无法提供足够负压以获得具有代表性样本。与啄木鸟取样技术类似，该方法要求针头以不同角度快速刺入组织，以便从多个平面采集样本，从而提高诊断价值。移除针头之前，必须先释放负压，以防止样本被吸入注射器并丢失。由于该技术涉及负压抽吸，因此细胞破裂可能性较高。所以，该方法主要用于当啄木鸟取样技术无法获得足够样本时，对病变组织进行补充取样。

• 表浅病变印迹涂片和刮片可提供重要诊断信息。然而，溃疡性皮肤病变通常覆盖一层表浅物质（如血清、碎屑和表浅细菌），这些物质可能无法反映深层组织病理情况。因此，进行印迹涂片之前，建议使用生理盐水浸湿纱布轻轻擦拭病变表面，借以除去表浅层，避免获得无诊断价值样本。清洁后，可采用生理盐水湿润棉签擦拭病变表面，或使用垂直于组织钝刮刀轻刮，以获取更充分样本。如果使用棉签采样，应在干净载玻片上轻轻滚动棉签，而非摩擦，以均匀沉积样本。而对于刮取样本，则应先将采集物质转移到载玻片上，再使用另一片载玻片进行推片（参图1压片技术）。尽管印迹涂片和刮片能提供一定诊断信息，但仍建议优先选择细针抽吸取样，以提高诊断准确性和价值。

• 切除组织印迹涂片可提供高质量诊断样本，但在制备涂片前，应使用纱布或毛巾轻拭组织表面，直至仅有极少量血液或血清渗出。过多液体可能会影响样本细胞浓度及其在载玻片上粘附性，从而降低诊断价值。如果载玻片上未残留多余血液或液体，则无需进一步扩展样本。但如果印迹涂片未能获得足够完整有核细胞，可采用替代方法——使用手术刀刃垂直于组织切面轻刮，并将刮取的细胞转移至载玻片上后再进行推片（详见后续讨论）。这一方法可作为印迹涂片补充，以提高细胞获取成功率和诊断质量。

样本处理和制备对其诊断价值尤为关键。无论样本是通过啄木鸟技术取样、抽吸取样还是刮取技术获得，都必须使用压片（squash）制备技术，以将细胞均匀展开成单层，便于显微镜检查和病理评估。某些常见但不理想的样本制备方法可能会影响细胞可视化和诊断质量，不推荐使用这些方法，例如： 

• Blow-n-go 方法（参阅图1A）：指将样本快速喷射到载玻片上，形成大小不一、未展开的液滴（参阅图1C和图1D）；这会导致样本呈现厚厚的多细胞层，使细胞学评估变得困难甚至不可能。

• Starfish/squish-n-go方法（参阅图1B）：指将样本滴在载玻片上，然后用另一片载玻片轻轻按压后迅速提起。虽然这种方法可能在某些区域形成单层细胞，但大部分样本仍然排列不均，缺乏足够单层区域，影响诊断价值。 

推荐采用压片（slide-over-slide）制备技术，该方法可最大程度减少细胞破裂，同时保证细胞形态完整，显著提高细胞学分析的可读性和诊断价值。为确保压片制备技术成功，应遵循以下步骤：

切勿清洗和重复使用载玻片。

• 样本必须在每次制备载玻片后立即铺展，以防止样本过早干燥和细胞破裂。

• 轻柔操作，避免脆弱细胞（尤其是淋巴结样本）破裂。

• 制备压片时，先将样本转移至干净载玻片磨砂端附近，然后将另一片干净载玻片轻轻覆盖在样本载玻片上，不施加向下压力。随后，让上方载玻片以平滑、快速的滑动动作沿底部载玻片的长度方向滑离，从而均匀铺展样本，同时尽量减少细胞破裂。

遵循这些操作要点可提高细胞学涂片质量，使其更适合显微镜下评估，并提供更可靠诊断信息。建议提交样本前进行评估，以确保其具有诊断价值，从而节省所有关联方时间和成本。评估样本时，应从获得的4至6张载玻片中选择一张进行染色。不要选择最好或最差载玻片，而应选择质量适中载玻片。使用水性 Romanowsky染色剂（例如 Differential Quik Stain 套装）进行染色时，必须使用干净的 Copland 染色罐，即未用于“污染”样本（如粪便或耳道样本）的罐。按照染色剂制造商说明书进行染色，并自然风干载玻片。切勿使用热固定、压缩空气或吹干样本，以免因高温损坏或吹走细胞。使用显微镜检查载玻片样本，以确保其含有大量完整的、核形清晰的细胞，并形成单层分布（参阅图2）。如果样本不符合诊断要求，应按照上述推荐的细针穿刺活检技术重新采样，以提高诊断质量。如无法获得可诊断细胞学样本，则组织活检可能是更合适选择。此外，也可提交已有载玻片以尝试获取有限诊断信息。但这种情况下，临床当值兽医和养牛场主应意识到样本可能无法提供有价值诊断结果。

细胞学样本存储和运输需满足一些重要要求，以确保样本具备诊断价值。所有载玻片应单独标记，并放置在盒状塑料或塑料泡沫（Styrofoam）载玻片存放盒内进行运输。避免使用纸板、薄塑料载玻片夹或药瓶作为运输容器，因为它们不够牢固，运输过程中容易导致载玻片破损，进而无法读取（参阅图3）。

图1.Blow-n-go（A）和Starfish/Squish-n-go（B）样本示例；因这些样本未充分铺展，导致形成厚厚液滴（C 和 D），由于缺乏单层细胞分布而无法做细胞学评估。

图2.高细胞密度样本示例：提交前评估涂片，以确定是否具有足够细胞数量、良好铺展且可读取的单层细胞；本载玻片包含单层细胞区（A）和无法读取的厚细胞区（B）。注意：样本诊断价值不一定要求具有与本图相同细胞密度。

图3.为避免运输中载玻片破损，应使用坚硬塑料载玻片存放盒（A），而不应采用纸板或薄塑料载玻片夹（B）。

细胞学载玻片不得接触任何形式甲醛（包括蒸汽或液体），因为甲醛会固定细胞膜，导致染色困难或染色异常（参阅图4）；这种固定作用会影响细胞形态，使其难以进行准确病理学评估。甲醛容器应远离染色和包装区域：任何存放或使用甲醛区域应与细胞学载玻片染色、制备和存放区域严格分开，以防止交叉污染。细胞学载玻片必须单独包装和运输：细胞学载玻片应使用专门容器或载玻片盒包装，以避免意外暴露于甲醛蒸汽或液体；不得将细胞学载玻片与甲醛固定的组织样本混装，即使它们分别密封。禁止将细胞学载玻片与甲醛样本共同存放：不得将细胞学载玻片放入含有甲醛固定样本包装箱；不得在同一外箱内同时放置甲醛固定样本和细胞学载玻片独立盒子，即使它们彼此完全隔离。为什么要避免甲醛污染？即使细胞学载玻片未直接接触甲醛溶液，甲醛蒸汽也可能渗透密封包装并影响细胞质量；甲醛污染的载玻片可能出现染色不均、细胞膜固定异常，甚至导致细胞结构无法识别，从而降低诊断准确性。妥善管理细胞学载玻片存储和运输，确保它们远离甲醛，是保证细胞学诊断质量关键步骤之一。

提交表格应完整填写，包括以下重要信息：患牛基本情况（原场编号、年龄、性别、品种等）、异常或特殊体检发现、相关病史、临床当值兽医鉴别诊断列表、病变部位、大小、外观和持续时间。如评估的是皮肤病变，应明确说明病变是否位于真皮层（随皮肤一起移动）或皮下组织（可独立于皮肤移动）。病理学家会将细胞学检查结果与提供的病史相结合进行分析。如信息不足，诊断结果可能仅会给出模糊结论。相反，若提供信息包含大量无关细节，则可能会延误样本分析，因为病理学家需要额外时间筛选记录，或需联系临床当值兽医进行澄清。

图4.运输过程中暴露于甲醛蒸汽的载玻片会导致细胞变色，使其内部结构无法评估。

细胞学检查存在一定局限性，提交病变样本时应加以考虑：

• 炎症会干扰许多细胞类型的细胞学特征，使良性与恶性变化难以精准区分。

• 细胞学检查无法评估组织整体结构，因此许多组织中，恶性程度或侵袭性难以精准判断。

• 分化良好的肿瘤可能难以与“正常”或增生性细胞群区分，影响诊断准确性。

液体样本可能包括体腔液体（腹腔、胸腔、心包）、关节液、脑脊液（CSF；腰椎或寰枕部位）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage=BAL）、气管穿刺冲洗液（transtracheal wash=TTW）、子宫冲洗液、胆汁、尿液、乳汁、脓肿液或囊性液体。所有这些液体或积液均可通过细胞学检查进行评估。与大多数组织细胞学样本类似，这类检查的主要目标是评估所采集液体性质，以确定其是否“正常”，或是否含有增生性、炎症性或肿瘤性（良性或恶性）细胞，并分析导致其形成的病理过程，例如异常生成、排出受阻或外源性因素。液体分析可提供重要病因线索，但经常无法直接确定其具体成因。

关于液体样本采集详细步骤和具体部位可在许多专业书籍中找到，此处赘述。如液体量充足（>1毫升），所有提交样本（见下方“例外情况”）应分装至以下容器中：紫帽试管(ethylenediaminetetraacetic acid=EDTA)，用于核细胞保存；红帽试管（无添加剂），用于生化检测（如胆汁酸、肌酐、葡萄糖、乳酸、钾、甘油三酯）；无菌试管：用于培养（需氧/厌氧细菌及/或真菌培养）。如液体量不足，临床当值兽医必须根据具体病例需求决定最重要检测项目。通常，细胞学评估和微生物培养是首选。

体液环境对细胞具有较强破坏性，会导致细胞快速降解。体液中存放仅24至48小时，细胞通常已变得难以识别。因此，临床当值兽医可采取以下措施，以最大限度提高样本诊断价值：

1.从未浓缩样本直接涂片制备两张载玻片，可使用血涂片法或压片法（squash technique）。

2.离心约0.5–1毫升轻柔混匀液体，在1500–2000转数/分钟（450克）下离心3至5分钟。

3.使用折光仪测定离心后上清液总蛋白含量。

4.从离心浓缩沉淀物中直接涂片制备两张载玻片，可使用血涂片法或压片法。

5.血性液体应离心，并使用微量血细胞压积管（microhematocrit tube）测定红细胞压积和总蛋白。

6.胸腔、腹腔和心包积液可在台式血液学分析仪上进行总核细胞计数（total nucleated cell counts =TNCC）前提是样本无凝块。

例外情况：所有脑脊液应存放在红帽试管（无添加剂），不得加入任何防腐剂。如采集量足够，仅需制备两张未浓缩样本的直接涂片载玻片；关节液由于粘稠度较高，若未添加透明质酸（hyaluronic acid），则难以成功处理。因此，提交滑膜液（synovial fluid）样本时，不建议执行上述步骤。

所有样本运输过程中需保持冷藏，可使用冷藏袋或冷冻冰袋，以保护细胞结构并防止微生物过度生长。 

样本寄送要求：管状样本和载玻片应存放在塑料泡沫或坚固塑料容器内，以防止破损。使用冷藏运输，建议选择隔夜快递，以确保样本最佳诊断效果；严禁暴露于甲醛其蒸汽，否则样本将无法使用。

如前所述，提交表格应完整填写（参见前述提交表格部分）。对于液体细胞学样本，还应包括以下关键信息：抽取液体总量；提交液体容积；液体初始颜色及性状（如浑浊度）；已测定的红细胞压积和/或总蛋白值（如有）。

液体细胞学局限性（与组织细胞学相似）：

1.炎症会干扰许多细胞类型细胞学特征，使良性与恶性变化难以精准区分。

2.细胞团聚（尤其是白细胞）使得难以区分或评估异常细胞形态特征或细胞内病原体；这种限制最常见于滑液（关节液）、支气管肺泡灌洗液和气管穿刺冲洗液样本中。

3.囊性液体由组织衬层或肿块细胞产生，通常诊断价值较低，因为其中含有极少甚至无核细胞；因此，建议同时提交囊壁组织穿刺样本，以提高诊断准确性。

血液样本可用于多种检测，提供大量临床信息，包括但不限于：全血细胞计数、不同器官系统血清或血浆生化检测、毒理学检测、营养评估检测。血液分析的目标：识别受影响器官系统，并确定导致异常分析指标的病理生理机制。提供支持性证据，帮助临床当值兽医：制定优先问题列表和鉴别诊断列表；确定是否需要增加额外补充检测以进一步明确病因；设计治疗方案；监测患牛治疗反应。

研究表明，大多数血液采样错误（高达77%）发生在采样现场，即在样本提交之前。血液采样错误常见原因首先是本该可以避免的错误：静脉穿刺技术不当导致溶血、选择错误采血管、样本标签错误、存储不当（温度、时间等）、不正确包装影响样本运输至兽医诊断实验室的质量。其次是不可避免影响因素：生物节律（如日夜变化）和环境因素（温度、湿度等）。此外，儿茶酚胺（应激时释放）、某些药物（如糖皮质激素）、日粮/营养补充剂也可能影响检测结果，使其难以解释和应用于临床问题。最后，溶血、乳糜血（脂血）、黄疸可能显著影响血清生化分析特异性，进而影响诊断准确性。

采集高质量、具备诊断价值血液样本关键要素： 

• 选择合适静脉穿刺部位：应选择最快、最安全、最少创伤部位，一般是颈静脉或尾静脉。

• 清洁静脉穿刺部位：确保穿刺部位清洁，以避免样本污染或将表面杂质引入体内；可使用清水、湿巾或酒精进行消毒。

• 静脉穿刺采血与留置导管采血：如患牛已留置导管，可直接从导管取血，但应丢弃最初采集的6毫升，以防止冲洗液、输液或残留药物稀释样本。

• 真空采血管采血与连针注射器采血：真空采血管采血法是首选方法，因其仅需一次穿刺即可直接将血液抽入采血管，可最大限度减少溶血。若使用连针注射器采血，应选择合适注射器规格，避免负压过大导致：静脉血管塌陷、红细胞破裂（溶血）、采血困难、血小板活化和过早凝血。小动物（如驹、犊、羔羊、幼畜），因其血压较低，可能更适合使用1-3毫升注射器采血。无论哪种方法，针头规格不应小于23号，以减少溶血对分析结果影响。

• 选择合适采血管：选择采血管应参考兽医诊断实验室建议，因促凝剂或凝胶会干扰某些分析物测定。

• 采血管所需采血量：添加试剂采血管（如EDTA、柠檬酸盐、氟化物）必须采血至指定刻度；采血过量会稀释添加试剂，降低检测准确性；采血量不足会导致添加试剂浓度过高，影响分析物测定。采血管误差与采血量不足或过量程度成正比。真空采血管采血可自动控制血液采集量，避免过度压力。连针注射器采血法时，应移除采血管橡胶塞，再取下注射器针头，直接从注射器将血样注入采血管，以减少血细胞因高压回流针头造成溶血。例外情况：柠檬酸抗凝管（蓝帽）必须精准填充血量至刻度线，其负压足以自动吸取适量血液。正确方法：用18号针头穿刺蓝帽管橡胶塞，使血液自然流入采血管。

• 采血管填充血样顺序（避免交叉污染）即正确的血液采集顺序：凝血试管（蓝帽，柠檬酸钠）、血清试管（红帽或虎纹帽，无添加剂或含促凝剂）、肝素试管（绿帽，锂肝素或钠肝素）、CBC（血常规）试管（紫帽，含钾EDTA）和葡萄糖试管（灰帽，氟化钠）。 

• 按照以上顺序采血填充采血管，可避免不同试管添加剂污染，确保分析结果准确性。血液样本后处理与运输要求：

• 血清试管（红帽）需静置至少30分钟，或直到完全凝固后才能离心。

• 离心后血清可转移至另一个红帽试管，或保留在血清分离管（serum separator tube）内，以便进一步检测。

• 制备血涂片：需制备1至2张新鲜、未染色、自然风干且正确标记血涂片，与全血和血清样本一同提交至兽医诊断实验室。包装要求：所有样本应放入硬质塑料盒或塑料泡沫盒（参阅图3），以防破损。 

• 血液是具有活性的液态组织，其细胞在运输过程中仍会继续代谢；由于细胞会随着时间老化，其形态特征可能在数小时内发生变化。防止血液样本变性的方法：分离血清和血细胞，以减少代谢产物对样本影响；所有样本需保持冷藏，以尽量减少细胞形态变化；尽快制备血涂片，因为新鲜血片包含保存最佳细胞，便于病理学家准确评估，特别在运输延误情况下。

制作高质量、可供诊断血涂片具体步骤已在许多教材中有所描述，此处从略。不过，以下是制作高质量血涂片关节要点：

• 切勿清洁并重复使用血涂片。

• 血涂片应均匀覆盖载玻片约一半至三分之二区域（参阅图5A）。

• 血涂片应充分展开，以提供红细胞、白细胞和血小板单层分布，从而便于观察单个细胞及其内部结构（参阅图5B）。

• 血涂片应尽量减少细胞破坏或破裂（参阅图5C）。

• 血涂片必须具有可见的“计数窗口”（参阅图5A和5B）。

• 血涂片不应出现不规则断裂线。

为确保制作出高质量血涂片，建议提交前先评估其中一张样本载玻片。选择一张血涂片，并使用水性 Romanowsky染色剂（如Differential Quik Stain试剂盒）进行染色。此过程应在“清洁”的Copland染色罐中进行，即未曾用于粪便或耳部细胞学样本染色的罐体，并严格遵循制造商使用说明。使用显微镜检查样本载玻片，确保其呈现清晰可见、完整有核细胞（白细胞），并在单层（计数窗口）中均匀分布（参阅图 5A和5B）。如果样本未达到标准，应重新制作几张血涂片，同时避免过度染色，并评估其诊断价值。

图5.血涂片覆盖载玻片三分之二（A），并具有较大计数窗口（粗黑箭头）；注意：单个细胞内部结构清晰可见（B），且细胞破坏或破裂最小；破裂细胞由小黑箭头标示（C）。

如前所述，所有样本从现场运输至兽医诊断实验室时，应使用冷却包或冷藏保存，并在包装入适当运输容器前正确标记，然后通过冷却包进行隔夜快递。采集后超过24小时才送达的样本可能会发生伪影变化，这些变化通常足以严重影响检测结果准确性。极寒条件下运输血涂片和组织细胞学样本时，可在现场进行固定处理。具体方法：将载玻片浸入水性 Romanowsky染色试剂（例如Differential Quik Stain套装）甲醇溶液中15至20秒后风干，并使用保温容器包装，以保护细胞完整性，防止运输过程中发生细胞裂解。此外，若这些样本暴露于甲醛或甲醛蒸汽中，将无法用于检测。提交表格应完整填写（详见前述提交表格部分）。

四、如何确保奶牛场现场实地即时检测准确性和可靠性？

发达国家相当数量当地兽医诊所，以及我国若干规模化现代奶牛养殖集团中心实验室均配备了各种类型的室内检测设备，为确保这些设备提供结果准确可靠，操作人员必须对结果质量进行控制。因此，所有中心试验室都应建立质量保证（quality assurance=QA）体系（计划），并为每台设备制定书面条例，以确保定期维护、校准以及某种形式的质量控制（quality control=QC）监测。这些措施可确保设备提供准确可靠的检测结果。血液学和生化分析仪正确校准尤为重要，因为测量错误可能会导致错误医疗决策，从而危及患牛健康。对于某些严格受控分析物（如钙、肌酐、钾），即使轻微校准失误也可能决定采取积极或保守治疗方案，甚至影响患牛生死。由于检测结果可靠性极度重要，因此定期对设备进行可靠性测试同样重要。不准确结果不仅影响患牛救治成功率和预后，还会影响诸如基层员工积极性、中心实验室发展与声誉、具体操作人员奖金收入和上级领导满意信任度等等；故而，建立完善质量保证体系-质量控制监测惠及所有人。

设备可靠性取决于其准确性或偏倚性（系统性偏倚误差）以及可重复性或精密度（随机误差）。消除所有误差是不现实的，因此，将误差控制在可接受范围内是目标。制定这些误差范围是为了确保误差发生时，临床解释和/或结果不会受到不利影响。美国兽医临床病理学会业已公布了大多数血液学和血清生化报告中分析物的“允许误差”标准。

为尽量降低血液学和生化设备误差，质量保证体系应当：包含避免分析前误差规范；尽量减少干扰物质（脂血、溶血、黄疸）影响；采用能代表受检患牛群体和服务地区的参考区间值；定期使用质量控制材料（quality control material=QCM），以确保报告结果准确性（尽量降低导致不准确的系统性偏倚）和可重复性（尽量减少随机误差以提高精密度）。不幸的是，由于额外成本和时间要求，实践中罕见使用质量控制材料。然而，这种做法存在问题，因为使用质量控制材料是维持既定准确性和精密度水平、从而确保高质量有效救治患牛的最佳方法。有几种方法可以降低质量控制材料成本，但这可能会导致设备误差未被发现风险。尽管如此，采取一些措施总比完全不用要好。降低成本方法包括以下几种： 

• 增加现场即时检测数量，以分摊每次测试所需质量控制材料成本；这需要严格遵循质量控制体系规定。 

• 仅在室内实验室进行关键血液检测，并适当收费以涵盖质量控制材料成本；需注意，这可能会增加检测费用。

• 采取折中策略，进行合理定价的现场即时检测，并减少“正常”质量控制材料使用频率。通常，应每日运行质量控制材料，或在设备发生变化时运行，包括设备开机、校准、维护、更换试剂，或出现可疑患牛结果。因此，应提前规划。例如，可在整个工作周保持分析仪开启，并在周一营业开始时运行质量控制材料一次。此外，还可考虑仅使用一个水平（正常水平）的质量控制材料，而非两个。安排例行维护、维修和试剂更换时，尽量与工作周结束同步进行。如果在一周内发生变化，则应在变化后运行质量控制材料以确保检测误差在可接受范围内。

• 如果质量控制运行表明分析物检测结果不准确或不可靠，则在继续使用设备之前，必须采取一系列措施（参阅图6）。

性价比最佳的质量控制管理方式是确保员工经过良好培训并记录所有相关信息，包括规定、流程、日期、时间、责任人、操作时间、地点和方法。此外，还应采取以下措施： 

• 通过血涂片复查确认血液学检测结果。

• 对比分析仪测得的红细胞压积（HCT）与离心测定的红细胞压积（PCV），以验证检测一致性。

• 与使用相同设备型号的其它奶牛养殖集团中心实验室建立对比协作关系，每6-12个月，各中心实验室应在大致相同时间，使用各自分析仪对同一份血样进行检测；随后，各成员共享所有分析仪数据，以确保检测结果相似。由于不同分析仪存在轻微差异，因此不太可能在同一血样上获得完全相同结果，但数据应保持在可接受范围内。 

全球许多兽医诊断实验室中，关于质量控制材料的使用存在两个常见误区，这些误区限制了其在质量控制流程中的广泛应用。

• 误区1认为台式分析仪具有内部控制，使用质量控制材料变得不必要：尽管台式分析仪确实配备了内部质量控制功能，但这些功能主要用于监测设备的电子、光度和/或机械性能，无法评估设备、操作员、试剂及其与全血或血清的相互作用。因此，质量控制材料作为分析物检测的外部质量控制工具不可或缺，应使用设备制造商推荐的商用质量控制材料以确保检测结果准确性和可靠性。

• 误区2认为“正常”患牛的血液和血清可保留至次日，并重复用于质量控制流程：尽管基于重复罹病动物测试的质量控制（Repeat patient testing-based quality control=RPT-QC）已被研究，并在犬类血液/血清情况下认为可行，前提是实验室能够每日获取正常犬血。然而，这一观点某种程度上具有误导性，因为在实施重复罹病动物测试的质量控制之前，必须进行详细的流程验证。该流程包括从20份正常犬样本中收集初步数据，并为每种分析物设定控制限度。如果没有初步数据作为质量控制材料参考，保存的患牛血清用于重复测试可能会受到样本降解影响，导致日间变异较大。此外，目前尚未发现任何关于重复罹病动物测试的质量控制在反刍动物物种中的验证研究，因此在这些物种中应用该方法可能存在较大不确定性。

不幸的是，遵循误区1和/或误区2的做法可能会影响现场即时检测结果可靠性，徒增基层员工抱怨和不满，并使临床当值兽医承担关联责任风险和失却信任。如临床当值兽医需要依据检测结果做出影响患牛生命的救治决策，那么实施正式的质量保证-质量控制方法以确保分析设备准确性和稳定性才是最合理且必要的选择。

图6.质量控制物质（QCM）运行示意图（within acceptable limits=WAL：可接受范围内）。

1.制定并执行定期维护、校准和验证的质量保证体系对于确保设备准确性和可靠性至关重要。

2.所有兽医诊断实验室均应建立质量保证体系，以优化所有设备诊断质量并提高检测结果可信度。 

3.应用质量控制材料是质量保证体系可否成功的核心组成部分，有助于确保设备准确性和精密度。

4.追求绝对检测零误差是不现实的，但目标应是将误差控制在可接受范围内，以维持检测临床价值。 

5.切勿仅依赖台式或现场即时检测设备的内部控制作为良好质量控制的充分证据，外部质量控制同样不可或缺。

6.如果质量控制运行结果超出可接受范围，则必须立即停止使用该设备，直到其经过维修、更换或重新校准后恢复准确性方可继续使用。

我国奶牛临床当值兽医在提交高质量临床病理样本方面，与发达国家（如美国、加拿大、欧盟等）同行存在一定差距。这一差距主要体现在培训体系、实验室基础设施、质量控制以及技术应用等方面。根据行业观察和专家评估，这一滞后程度至少15年以上，但因地区和机构不同，情况有所不同。以下是具体分析：

1.培训与教育体系

（1）发达国家：兽医教育体系高度成熟，在兽医病理学、实验室诊断学等课程中，强调样本采集、处理和提交标准化流程。许多国家还要求兽医进行就业后继续教育，确保知识及时更新。

（2）我国：近年来，兽医教育体系进步显著，尤其是高校和大型企业加强了临床病理学培训。但基层临床当值兽医仍缺乏系统性临床病理样本采集和处理培训，导致样本质量参差不齐。迄今为止，我国并未实行任何就业后继续教育项目来使临床当值兽医专业素养与时俱进、持续更新。

（3）差距估计：在标准化培训和最佳实践普及程度上，我国可能落后15年左右，但一些高端兽医机构正在快速缩小这一差距。

2.实验室基础设施与质量控制

（1）发达国家：拥有完善兽医诊断实验室，并对样本提交有严格标准化要求，如ISO17025认证、美国兽医实验室诊断协会（AAVLD）标准等；实验室通常配备自动化分析仪、数字病理系统，确保高效、准确诊断结果。

（2）我国：虽近年来兽医诊断行业快速发展，但部分地区仍缺乏高标准实验室，且样本处理流程规范化仍需进一步加强。此外，许多临床当值兽医仍习惯将样本直接送至人医实验室，导致数据解读偏差。

（3）差距估计：基础设施建设和质量控制体系完善程度上，我国可能落后20年左右，但大型企业和政府投资正加速弥补这一不足。

3.技术应用与最佳实践

（1）发达国家：兽医病理学领域已广泛采用数字病理学、自动化样本处理、分子学诊断（PCR、NGS）、远程病理诊断等技术。这些技术不仅提高了诊断准确性，还改善了数据管理和可追溯性。

（2）我国：国内顶尖兽医机构如高校附属兽医院、大型乳业实验室已开始应用这些新技术，但全国范围内普及程度仍然有限，基层奶牛临床当值兽医对这些新兴技术认知度和使用频率仍较低。

（3）差距估计：技术应用和标准化实施方面，我国可能落后15年左右，但随着行业投资增加，这一差距预计将在未来几年快速缩小。

4.标准化流程执行与推广

（1）发达国家：兽医实验室诊断标准化程度较高，如美国兽医临床病理学会和欧洲兽医临床病理学会均制定了一系列标准化指南，确保样本提交的质量和一致性。

（2）我国：虽然部分行业协会和学术机构已开始推广标准化样本采集、存储和提交流程，但在全国范围内尚未形成统一行业标准，导致不同实验室之间检测结果可能存在较大差异。

（3）差距估计：标准化流程普及和执行方面，我国可能落后15年左右，但已有显著改善，尤其是在规模化养殖场和大型乳业实验室中，标准化意识正在迅速提升。

总体而言，我国奶牛临床当值兽医在提交高质量临床病理样本方面，与发达国家同行差距大致在20年左右之间，具体取决于：

1.培训体系（落后15年左右）。

2.实验室基础设施和质量控制（落后20年左右）。

3.技术应用和最佳实践（落后15年左右）。

4.标准化流程的执行和推广（落后15年左右）。

然而，中国兽医行业正经历快速发展，尤其是在政府支持、企业投资和国际合作推动下，这一差距正在逐步缩小。预计在未来5-10年内，中国高端兽医诊断水平有望接近发达国家，关键在于加强培训、优化质量控制、推广标准化流程以及加速新兴技术应用。