牛源铜绿假单胞菌的分离鉴定及中草药抑杀效果比较分析

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中图分类号：S858.23

文献标识码：A

文章编号：1004-4264（2023）06-0026-05

DOI： 10.19305/j.cnki.11-3009/s.2023.06.006

牛源铜绿假单胞菌的分离鉴定及中草药抑杀效果比较分析

白和平¹，彭树德²，刘亦潇¹，吴同垒¹，张志强¹，张艳英¹，史秋梅¹

（1.河北科技师范学院/河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛 066004；2.唐山市食品药品综合检验检测中心，唐山 063000）

摘 要：为查明养殖场引起牛只呼吸道疾病的病原菌，采集患病牛鼻拭子，采用实验室方法进行细菌的分离鉴定；通过细菌毒力基因的检测、致病性试验、药敏试验分析分离菌生物学特性；并明确22种中草药对其抑杀效果。结果表明，分离菌为两端钝圆革兰氏阴性短杆菌，16SrRNA基因序列与GeneBank铜绿假单胞菌比对相似序列达到100%，表明分离菌株为铜绿假单胞菌；菌株携带Exo S、Exo Y毒力基因，8h内可致小鼠死亡。药敏试验结果显示，该菌对环丙沙星极为敏感，对阿米卡星、新霉素、复方新诺明等9种药物中度敏感；中草药药敏试验结果显示，乌梅、五倍子对分离菌具有较好的抑菌作用，其MIC分别为31.25mg/mL和62.50mg/mL，对病原菌的生长繁殖具有较好抑制作用。本研究为该病的防控提供参考。

关键词：铜绿假单胞菌；生化特性鉴定；毒力基因；中草药抑菌试验；致病性试验

铜绿假单胞菌即绿脓杆菌，属于革兰氏阴性菌，有鞭毛、无芽孢，广泛存在于水源、土壤、空气等自然环境中，为条件性致病菌，主要引起呼吸道疾病。近年来陆续报道该菌引起不同动物源性疾病，据报道已在貂、鹿、鸡、小熊猫、獭兔、猫、犬、狐等动物体内分离出致病性铜绿假单胞菌，其危害极大，造成经济损失重大，应当予以重视。

2021年12月河北省秦皇岛市抚宁区某牛场牛只出现流鼻涕、呼吸困难、咳嗽等呼吸道症状，临床诊断为细菌感染，对样品进行病原体的分离，得到一株优势菌；通过致病性试验和毒力基因的检测揭示了牛只发病原因，进一步通过药物敏感试验和中草药体外抑菌试验，为其治疗提供了科学参考。本试验为进一步研究铜绿假单胞菌提供基础。

1、试验材料

1.1 样品来源

样品来源于河北省秦皇岛市抚宁区某牛场患病牛鼻腔10cm深处的鼻腔黏液，冷藏保存送至试验室。

1.2 主要试剂及仪器

血琼脂培养基，购自北京陆桥生物科技有限公司；抗生素药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；ID32E生化鉴定试纸条、ATB全自动生化鉴定仪，购自法国梅里埃生物公司；革兰氏染色试剂、乙酰胺琼脂、麦康凯肌醇阿东醇氨苄青霉素钠琼脂，购自青岛海博公司；中草药提取液为本实验室自制，浓度为1g/mL。

1.3 引物设计与合成

参考有关文献合成铜绿假单胞菌毒力基因序列和细菌16S rRNA基因通用引物，由上海生物工程有限公司合成特异性引物，引物信息见表1。

表1 引物信息

2、试验方法

2.1 分离菌的分离纯化及形态学观察

在超净台中取出鼻拭子放入5mL EP管内，加入2mL无菌PBS，充分旋转挤压。取菌液在血琼脂培养基划线，37℃培养24h后挑取优势菌落划线纯化，再分别挑取单菌落接种于LB液体培养基37℃震荡培养过夜，划线于LB培养基、乙酰胺琼脂、麦康凯肌醇阿东醇氨苄青霉素钠琼脂平板观察细菌形态，并进行革兰氏染色。

2.2 分离菌16S rRNA序列比对分析

采用水煮法提取细菌DNA基因组，利用细菌16S rRNA基因通用引物对细菌cDNA进行PCR扩增，反应体系与反应程序均参考相关文献，将16S rRNA阳性产物送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果在NCBI网站中分析16S rRNA的同源性，并建立发育进化树分析种属关系。

2.3 分离菌生化特性鉴定

使用比浊仪调整菌液浓度为0.5麦氏比浊度，生化试纸条每孔滴加70μL菌液，并在第1～7孔分别滴加1滴10%灭菌甘油，放置在湿盒内于37℃培养箱培养24h后使用ABI全自动生化鉴定仪读取结果。

2.4 分离菌毒力基因检测

采用PCR法检测分离菌株携带毒力基因情况，利用1.3中提到的Exo U、Exo S、Exo T、Exo Y基因的引物，对提取的细菌cDNA进行PCR扩增，反应条件和反应程序参考相关文献。

2.5 抗生素药敏试验

采用K-B试纸法进行抗生素药敏试验，参照CLSI 2019年标准进行，每种抗生素做3个重复试验，取其平均值作为最终结果。

2.6 中草药药敏试验

抑菌效果的测定：用煎煮法制取中草药提取液，使其生药浓度为1g/mL。采取琼脂扩散法检测该分离菌对中草药的敏感性，试验方法与结果判定遵照相关参考文献。

中草药体外最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）测定：采用棋盘法在96孔板中将药物等体积稀释，设定每孔总体积为200μL，2～11孔每孔加100μL培养基，第2孔加100μL中草药等体积稀释至第9孔，第2～10孔每孔加100μL菌液，第10孔为阳性对照，第11孔加100μL超纯水做阴性对照，每种中草药做3个重复，置于37℃培养箱培养24h，无菌生长孔即为MBC。在最小抑菌浓度的基础上继续培养24h后，测定中草药对致病菌的MIC，观察试验孔澄清透明，进行细菌PCR检测，做3个重复，若PCR结果为阴性则该孔药液浓度为最小杀菌浓度，结果判定参考相关文献。

2.7 致病性试验

应用普通级健康小鼠进行致病性试验，调整菌液OD600为0.6，小鼠分为试验组与对照组，每组各5只。采取腹腔注射方式对试验组注射菌液200μL/只，对照组注射同等剂量生理盐水，连续观察7d。对死亡小鼠及时取肺脏组织进行检测。

3、试验结果

3.1 分离菌的分离纯化及形态学观察

分离菌在血平板上生长良好，呈露珠状、表面光滑且伴有β溶血现象；在普通琼脂培养基上生长的菌落呈针尖样大小半透明、产绿色素；在乙酰胺琼脂培养基上生长可使平板颜色由浅粉色变为粉红色；在麦康凯肌醇阿东醇氨苄青霉素钠琼脂平板上不生长；染色为革兰氏阴性两端钝圆的短杆菌。

图1 分离菌株形态学检测及中草药抑菌试验结果

A.分离菌在TSA培养基上生长状态 B.分离菌在LB培养基上生长状态 C.分离菌在乙酰胺琼脂培养基上生长状态 D.革兰氏染色镜检结果（1000×）E.分离菌在LB液体培养基中生长情况 F.部分中草药药敏试验抑菌圈图

3.2 分离菌16S rRNA序列比对分析

通过16S rRNA基因扩增，扩增出1 500bp左右条带，与预期目的条带相符。经NCBI中blast同源性比对，与铜绿假单胞菌参考菌株同源性高达100 %，并将该菌命名为TL-1。进化树结果显示（图2），TL-1与参考菌株KDQ4、ALK319、fwzb12、LW20同源性为100%，亲缘关系最近，与参考菌株ALK320、S2QBS8、HNYM41、HNYM10株同属一支，以上结果证实该菌为铜绿假单胞菌。

图2 分离株TL-1系统发育进化树

图3 分离菌毒力基因Exo S与Exo Y检测结果

3.3 分离菌生化特性鉴定

取经24h培养的生化鉴定试纸条，在IND孔滴加1滴吲哚试剂，使用ATB自动生化鉴定仪读取试验结果。生化结果显示：该菌株产生水解酯酶、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱氢酶；产生丙二酸盐；分解葡萄糖、阿拉伯糖，不发酵麦芽糖；吲哚试验为阴性，与铜绿假单胞菌生化特性相符。

3.4 分离菌毒力基因检测

采用PCR法对分离菌的Exo U、Exo S、Exo T、Exo Y相关毒力基因进行检测，结果如图2所示，分离菌株携带Exo S、Exo Y毒力基因。

3.5 抗生素药敏试验

药敏试验结果如表2所示，该分离菌对环丙沙星敏感，对阿米卡星、新霉素、复方新诺明等9种药物中介，对氨苄西林、阿莫西林等14种抗生素耐药。

表2 抗生素药敏试验结果

注：抑菌圈直径≥20mm为S，10mm≤抑菌圈直径＜20mm为I，抑菌圈直径＜10mm为R。

3.6 中草药药敏试验

各中草药抑菌圈测量结果如表3所示，TL-1菌株对五味子、乌梅、五倍子这三味中草药液极度敏感；对诃子与石榴皮两种中草药提取液高敏；对板蓝根与黄苓两种中草药提取液中敏；对苏木、蒲公英、黄连等15种中草药提取液耐受。结果表明，五味子、乌梅等7种中草药对TL-1具有较好的抑菌效果；苏木、蒲公英、黄连等15种中草药对分离菌抑菌效果较差或无抑菌效果。

表3 中草药药敏结果

注：抑菌圈直径≥20mm为S，10mm≤抑菌圈直径＜20mm为I，抑菌圈直径＜10mm为R。

选取具有明显抑菌作用的7种中草药，测定其对分离菌的MIC与MBC，检测结果显示（表4），乌梅、五味子抑菌效果与杀菌效果最强，其MIC分别为31.25mg/mL、62.50mg/mL，MBC分别为62.5mg/mL、125mg/mL；五倍子、诃子、石榴皮、板蓝根、黄苓其MIC、MBC分别在62.50～125mg/mL和125～250mg/mL之间。

表4 中草药最小抑菌浓度与最小杀菌浓度

3.7 致病性试验

4、结论与讨论

本研究通过对优势菌的生长特性、革兰氏染色、生化鉴定和生物信息分析鉴定，证实该分离株为铜绿假单胞菌。本分离株在LB培养基产绿色素，而魏成威等研究的北极狐源铜绿假单胞菌和王月虎等研究的猛禽源绿脓杆菌不产色素有所不同，与赵淑梅等研究的人源肺心病患者产紫色素铜绿假单胞菌也不同，与肖咪云等研究的牛大力源产天然蓝色素铜绿假单胞菌亦不同，这可能与菌株的差异性以及相关色素基因的表达有关，建议在实验室检测过程中要多重方法相结合，以免漏检误检。

目前由于抗生素的滥用，导致菌株耐药性不断增强，有多重耐药表现，而耐药性的增强主要有两个方面原因，一方面是耐药基因的垂直传播，另一方面是基因重组在质粒上，通过转导、转化、接合的方式传播其耐药基因。抗生素药敏试验显示分离菌株对氧氟沙星耐药，而此兽药早在2015年原农业部已停止受理品动物中该文号的申请，2016年底已禁止使用于食品动物，但至今仍能检出耐药，这可能与药物残留和耐药基因的水平传播有关，这样证实了抗生素滥用的危害后果是难以在短期内消除的。本文中抗生素药敏试验对铜绿假单胞菌的抗菌谱研究具有参考意义，在临床用药时要严格执行国家兽药使用有关规定和政策。新型药物研制的速度赶不上细菌耐药性变化的速度，中草药重新回到人们的视野。本研究筛选出五味子、乌梅、五倍子、诃子、石榴皮、板蓝根等敏感中草药，其MIC和MBC在31.25～125mg/mL和62.50～250mg/mL之间，与李振等研究的22种中草药抑制铜绿假单胞菌（ATCC27853）结果有一定的偏差。有相关研究表明中草药可抑制菌株毒力，因此可以合理使用中草药防治细菌性疾病。本课题组人员将继续进行中草药对该菌毒力基因削弱或消除的相关机制研究，以期为该菌的防治提供科学依据。抗生素药敏试验显示，该菌株对环丙沙星极为敏感，对阿米卡星、新霉素、复方新诺明等药物中介，与刘勃兴等分离的铜绿假单胞杆菌药敏结果符合，但与李淑红等研究的奶牛源铜绿假单胞菌药物敏感性试验结果不符，这可能是菌株流行情况、菌株的耐药基因、用药措施不同而导致试验结果有所差别。

铜绿假单胞菌可通过气溶胶传播，属条件性致病菌，容易在潮湿的环境中滋生，常存在于皮肤、呼吸道、消化道、尿道等部位，可在健康动物体内检出，易引起机体发病，严重的会导致宿主死亡。经调查本研究中牛只经过长途运输并饲养在半开放圈舍中，多种因素作用下诱发呼吸道疾病，在治疗过程中反复依赖于青链霉素、磺胺类药物治疗，效果较差造成了病情进一步加重，临床症状呈现出血性肺炎。通过本研究筛选出敏感药物环丙沙星结合中草药五味子、乌梅和五倍子，对患病牛只进行肌肉注射与灌服，呼吸道症状明显减轻；经用药一周后该牛场牛只基本痊愈，无明显呼吸道症状。这也提示在生产实践过程中不要依赖于常用药物，可根据药敏试验结果，采用联合用药、使用广谱抗生素或中西药联用等方式降低药残与耐药性。